外显子组测序（ES）：革命性的诊断工具在单基因疾病中的应用和快速外显子组测序（RES）的重要性

单基因（孟德尔）疾病是一种高度多样化的疾病，可以影响身体的任何器官，虽然个体罕见，但总体上相对常见。因此，即使是经验丰富的临床医师，在没有既往临床经验的情况下，也很可能在执业过程中遇到其中一些疾病。在一些环境中，如新生儿和儿科重症监护病房，特别容易出现单基因疾病的聚集。过去，诊断这些疾病一直是具有挑战性的工作，即使成功，也可能需要数年时间。然而，外显子组测序（ES）的出现彻底改变了这种情况，它突破了准确临床诊断的先决条件。事实上，现在即使临床医师无法准确识别临床诊断结果，也可以通过外显子组测序（ES）来诊断单基因疾病。

虽然大多数单基因病没有特异性疗法，但并不意味着分子诊断不能为重要的治疗选择提供指导，而且分子诊断还可以帮助避免无效或有害的干预措施。由于这类疾病大多罕见，才更加凸显分子诊断的价值。分子诊断不仅可以建立关于疾病自然史的必要知识库，制定监测指南，与患者及其家人共享数据驱动的预后信息。而且只有在获得分子诊断的情况下，才能准确地进行复发风险计算，这对生殖计划至关重要。这些临床应用的重要性促使美国医学遗传学和基因组学学会（ACMG）认可外显子组测序（ES）作为一级检测，用于具有挑战性的单基因疾病（如多发性先天性畸形和发育迟缓）的患者。

快速外显子组测序(RES)是一种特殊类型的外显子组测序（ES），其中从样本接收到报告生成的整个流程被压缩到几小时或几天，而不是常规临床外显子组测序（ES）的典型几周或几个月。快速外显子组测序(RES)的资源密集性质通常在某些临床情况下是合理的，在这些情况下，快速分子诊断被认为可以为急性临床管理决策提供信息。自2012年开始使用快速基因组测序（RGS）以来，在重症监护病房（新生儿和儿科）中展示了其重要价值，从最初的先锋性故事逐渐发展为随机病例对照研究，清楚地证明了该方法在临床上的实用性。然而这些研究主要是在亲缘关系较远的人群中开展的，所以我们迫切需要在亲缘关系较近的人群中测试快速基因组测序（RGS）的分析效果。之前我们已经有了在高度亲缘关系的人群中使用快速基因组测序（RGS）的初步经验，现在我们将新病例样本规模扩大到了189个，并重点研究了该方法的临床诊断效果。

快速外显子组测序（RES）：为紧急临床诊断提供帮助的可行研究方案

所有临床小组都被告知快速基因组测序（RES）是一种可行的研究方案，可以为需要紧急分子诊断的患者提供帮助。我们鼓励临床医生与研究团队（FSA）代表联系，提供病例信息。病例经过同一研究代表的评估，以便确保一致性。

本研究只纳入具有合理理由需要进行快速非常规分子诊断的病例。符合条件的病例包括：

（a）需要在达到法定截止日期(受孕后120天，即妊娠18.5周)前4周内做出终止妊娠决定的产前病例；

（b）重症监护病房（通常是新生儿或儿科）的病例，诊断不明确，需要准确诊断指导积极治疗或改变现有治疗方案；

（c）需要紧急决定是否适合进行肝或骨髓移植的病例。在开始采样之前，我们获得了所有参与者的知情同意，采样通常是通过采集静脉血样本（使用EDTA管）进行的。有时也会采集唾液样本，例如在白细胞减少症情况下，产前病例使用羊水进行采样。本研究已经得到当地伦理委员会的批准。

临床医生调查揭示：遗传病结果具有多领域的阳性临床效用

我们向临床医生进行了调查，并询问了他们对结果的临床效用的投入。我们使用了与Dimmock等人相同的四个领域进行评估：

第1类：患者管理和临床结局方面的变化：我们观察到患者在急性状况管理或临床治疗中出现了明显的变化。这包括筛查可能有遗传病并发症的患者、提供新的专科咨询、改变药物治疗方案、进行有创性手术的决策变化（例如移植或终止手术）、改变饮食方案、影像学检查的变化以及姑息治疗。我们通过评估是否成功使用了针对特定遗传疾病的靶向治疗、避免了并发症的发生以及提升了姑息治疗的质量来评估患者的临床结局变化。

第2类：沟通方面的变化：我们观察到与患者家属进行沟通时发生了变化。这包括对患者的结局、期望和预后进行更详细的沟通和解释。

第3类：后续检查顺序的变化：我们观察到由于我们的结果，医生可能会触发额外的确证性检查。这些额外的检查是为了进一步确认诊断或检测可能的并发症情况。

第4类：其他治疗变化：我们观察到医生可能会对进一步的咨询、监测或研究提出不同的治疗方案。

根据我们向临床医生的调查，我们发现当结果可以引起急性患者管理或临床结局方面的变化，或者当结果能够促进患者与家属的沟通，亦或者当结果导致额外的检查以及当结果引起其它治疗方面的变化时，这些结果具有阳性临床效用。

全新研究揭示：189例未发表的遗传病例中的突变分析与诊断关联

该研究包含189例尚未在任何学术出版物或医学期刊上发表的病例。这些病例的年龄范围从胎儿到40岁（不包括为推断死亡儿童的病因而接受检测的父母）。在这些病例中，有91名女性和101名男性。其中重症监护病房占比53%，进行这些病例检测的原因包括：

（a）其中67例属于急性ICU管理指导；

（b）关于移植（肝脏或骨髓移植）的紧急决定问题共有90例；

（c）产前决定共有9例，以及其它原因合计有23例。

在总共82个突变中有80例发现了阳性结果。这些突变跨越67个基因，13个是新基因，47个预测功能丧失(LOF)。80例阳性结果中有69个是常染色体隐性遗传，除去了2个非纯合子的情况，其余67例均为纯合子。

揭示新的基因-疾病关联：丰富遗传疾病的理解和诊疗指导

接下来，我们要讲的这两个案例研究讲述了新的基因-疾病关联，进一步丰富了我们对相关基因的认识，并为相关疾病的诊断和治疗提供了指导。

第一个案例是SCYL1基因与CALFAN综合征的相关性。在OMIM数据库中，SCYL1仅被列为自体隐性遗传的CCA1型脊髓小脑性共济失调。然而，Lenz等人报道了一种名为CALFAN综合征的新型SCYL1基因相关表型。患者Pat-1006表现为急性肝功能衰竭和脑病，并发现其具有纯合子剪接突变，支持了这种关联。

第二个案例是GALE基因的突变与血小板减少症的相关性。GALE基因编码UDP半乳糖-4-表达酶，其缺乏已知会导致半乳糖血症。令人惊讶的是，一种奠基者突变被发现引起了一种仅限于血小板减少症的不同表型。患者Pat-1039表现为血小板减少症、免疫性溶血性贫血、IgA和IgM降低以及反复感染，需要紧急决定进行骨髓移植。发现他纯合子携带了相同的奠基者突变。因此，他的表型既证实又扩展了与GALE相关的这种不同表型。

Pat-1001是一个胎儿，患有胎儿运动无力症。在进行快速基因组测序（RES）检测时，发现他携带COL25A1基因的纯合子截断突变。在OMIM数据库中，COL25A1仅列出了一个仅涉及眼部的表型（先天性眼外肌纤维化5型）。在编写本文稿过程中，我们意识到还有其他的COL25A1相关胎儿运动无力症的病例（正在提交修订版文稿）。因此，这代表了一个具有临床意义的表型扩展。

简而言之，这意味着COL25A1基因的突变不仅仅会导致眼部问题，还可能涉及其他肌肉的普遍运动无力症状。这个新的发现对于我们理解该基因的作用以及相关疾病的诊断和治疗具有重要意义。

意想不到的诊断结果：全外显子测序揭示潜在遗传性疾病的关键

患者Pat-1192是一个7岁的孩子，考虑将其作为一个紧急骨髓移植的候选人，用于治疗患有再生障碍性贫血的兄弟姐妹。对其兄弟姐妹进行了快速外显子组测序(RES)检测，以诊断再生障碍性贫血的病因，并排除兄弟姐妹（潜在的供体）的可能性。令人惊讶的是，虽然没有找到再生障碍性贫血的原因，但发现兄弟姐妹Pat-1055携带了一个致病性ATM基因突变，从而确立了遗传性小脑萎缩血管扩张症的临床未被怀疑的诊断，并排除了作为供体的可能性。

同样，患有青紫心脏病的患者Pat-1098出现了反复溶血危机，但没有明确的病因。发现一个致病性G6PD基因突变令人惊讶，因为先前的检测显示G6PD水平正常。后来发现，这些水平是在输血后太早测量的，无法真实反映内源性酶活性。另一个例子是患者Pat-1160，他表现出血吞噬淋巴组织细胞增多症（HLH）的特征，并有一个婴儿时期因类似症状而死亡的兄弟姐妹。令人意外的是，发现这位患者携带了GNS基因的纯合致病性突变。目前尚不清楚这一发现与主要病症是否有关。

简而言之，这些案例展示了一些意想不到的诊断结果，丰富了我们对疾病的理解。它们强调了进行全外显子测序的重要性，以揭示潜在的遗传性疾病和相关病因，为患者的诊断和治疗提供指导。

快速外显子组测序（RES）：关键的临床管理工具，改善患者的预后和避免无效治疗

在许多病例中，通过快速基因组测序（RES）获得的诊断结果对患者的临床管理产生了显著影响。

例如，患者Pat-1057表现出急性肝衰竭，但经过特殊的半乳糖血症饮食管理后，症状完全消失。令人遗憾的是，新生儿筛查没有检测出这一诊断。

另一个例子是患者Pat-1088，在发现他携带纯合子TCN2基因突变引起的钴胺素缺乏后，他表现出全血细胞减少症、骨髓异常增生综合征、外周血中5%原始细胞、轻度发育迟缓、皮肤色素沉着异常和肠梗阻。然而，在对他进行羟基钴胺素注射后，他的临床状况有了显著的改善。

还有患者Pat-1106，在补充鸟氨酸并限制蛋白质摄入后，他的症状完全恢复。经过进一步检查发现，他患有高鸟氨酸血症-高氨血症-同型瓜氨酸血症综合征，该综合征与slc25a15基因相关。

当PICU团队告知患者Pat-1132的父母，他的病情非常严重，患有进行性肌无力、延髓麻痹和呼吸衰竭，预后不太乐观时，他们差不多决定放弃进行复苏（DNR）措施。然而，在发现了与slc52a3基因相关的核黄素转运体缺陷后，立即给予核黄素治疗，患者的临床状况迅速显著改善，且目前正在门诊随访中。

需要注意的是，虽然SLC52A3和TCN2基因突变仍被认为是不确定意义的突变（VUS），但我们选择这些例子，是因为最近的研究提倡根据预期的治疗反应来进行诊断和治疗的决策。

总之，这些案例突出了快速基因组测序（RES）在诊断和治疗中的重要性，为医生提供了宝贵的指导和决策依据，以改善患者的临床状况。

有一些患者在接受快速基因组测序后发现了一些不确定意义的突变（VUS）。例如，Pat-1142患有mthfr相关同型半胱氨酸尿，出现了快速认知功能下降，还有广泛的脑血管病变和身体内的血栓形成。然而，在适当的治疗下，该患者取得了显著的临床改善。

另外，有一些分子诊断导致了无效治疗的停止。例如，患有plce1相关肾病综合征的患者Pat-1117停止了类固醇和免疫抑制剂治疗，并接受了肾移植，因为分子诊断表明这些治疗对其无效。而患有kcnj11相关先天性高胰岛素血症的患者Pat-1119停用了二氮嗪药物，而选择接受胰腺切除手术，取得了良好的效果。另外，患有神经鞘瘤病的患者Pat-1146经过基因测序发现其病因是神经鞘瘤病而非nf1相关的神经纤维瘤病，因此避免使用了selumetinib药物。

这些案例突出了快速基因组测序在改善患者的临床状况方面的重要性，为医生提供了指导，并避免了无效治疗的发生。

快速外显子组测序（RES）：为患者提供确切的诊断标签和疾病预后信息

在大多数情况下，临床医生非常高兴能够在进行基因组测序之前给患者一个确切且无疑义的诊断标签。他们可以向患者解释疾病的自然发展过程，并提供有关疾病预后的相关信息。这使得患者和其家属更清楚地了解病情，并知道可能会发生什么。

分子诊断：确认诊断的关键工具而非引发更多检查的来源

根据数据，分子诊断只触发了很少一部分的确证性检查，这并不包括与并发症或其他疾病特征相关的筛查。换句话说，大部分情况下，分子诊断并没有引发更多的确诊性检查，而是更多地用于确认已有的诊断。

多致病突变的遗传疾病：复杂风险评估与生殖咨询的重要性

在绝大多数阳性病例中，致病性突变是以常染色体隐性遗传方式传递的。这意味着可以向患者的父母提供生殖咨询，例如胚胎植入前遗传学检测或产前诊断，以确保未来孩子的健康。

然而，在有些情况下，发现多个致病突变使得复发风险变得更加复杂。例如，患者Pat-1000在怀孕期间发现了致病性FARS2突变，而另一个已故儿童则有不同的表型（严重低张力），并被发现携带家族性FARS2突变。为了确定风险，需要对这对夫妇以及另一个已故孩子的DNA样本进行更详细的遗传学检测。结果显示了LMOD3和BRCA2基因的纯合子突变，最终确诊为杆状体肌病。

在这种情况下，复发风险从1/4 提高到了7/16，并向夫妇提供了产前诊断的选择。如果是常染色体显性突变，并且已经确认新生儿的状态，则可能需要对父母进行检测，以了解最小遗传风险，并讨论亲代嵌合的可能性。在本研究中，只有一名患者（Pat-1052）观察到多位点致病突变，该患者携带了BRCA2和DCAF17基因的纯合子突变。这表明疾病的发病可能涉及多个基因。需要强调的是，我们在统计这些数据时仅考虑了所有突变均可能致病的情况。

快速外显子组测序（RES）：为罕见疾病诊断带来巨大成本节省

根据我们的研究结果，每个样本的快速基因组测序（RES）费用为2000美元。根据这个价格，这189个病例的总诊断费用为37.8万美元。

18岁以下的罕见疾病患者平均年医疗费用为80,436美元。在我们的研究中，接受治疗的患者平均年龄约为3岁。因此，我们估计这189名患者的每年治疗费用为1520.2404万美元。诊断费用占到总年度费用的2.48%。

特别是，在研究中有26例阳性病例需要进行骨髓移植或肝脏移植，手术的总成本为1462.8万美元。快速基因组测序（RES）诊断费用占到总年度治疗和手术费用的1.27%。

快速基因组测序（RES）的结果促使80例病例接受生殖咨询，每个病例都有可能阻止未来一个或多个患病婴儿的出生。根据保守估计，这80例病例将阻止25%的兄弟姐妹患病，从而每年节省160.872万美元的医疗费用，乘以平均年寿命。同样，快速基因组测序（RES）的结果改变了9例患者的治疗方法，避免了昂贵和禁忌的移植手术（6例肝脏移植和3例骨髓移植），节省了252.6万美元。

此外，快速基因组测序（RES）的结果将3例重症监护室患者的治疗转为姑息护理和不复苏状态，节省了19.867万美元的费用。假设这些患者平均在重症监护室停留30天，仅仅从这个群体中，快速基因组测序（RES）就能够节省超过433.339万美元的医疗保健成本，这意味着至少节省了395.539万美元。

快速基因组测序的临床效用和经济价值：亲缘关系较近婚配人群的特殊机会和测序技术的考虑

自从2012年首次引入以来，快速基因组测序或快速外显子组测序因其在精准医学中具有潜在的高诊断效果，受到越来越多的关注。它可以降低成本，改善资源利用，已经得到证明，并且在家长满意度方面得分较高。重要的是，多个研究小组已经证明了其临床效用，通常应用于新生儿和小儿ICU。同样，我们需要坚实的数据来证明快速基因组测序或快速外显子组测序的临床效用，以合理地覆盖这种比传统外显子组测序成本更高的特殊工作流程。这些数据应该包括不同的环境，包括亲缘关系较近婚配人群，这在快速基因组测序或快速外显子组测序的临床有效性研究中很大程度上是缺乏的。

亲缘关系较近婚配人群的自交性增加了发现罕见或新的遗传突变的可能性，为快速基因组测序或快速外显子组测序的临床应用提供了机会。这在我们的研究中很容易看到，其中有几个诊断病例非常罕见，甚至还没有在OMIM中列出。我们先前的研究表明，超过90%的家庭在接受咨询后会做出积极的生殖决策，例如产前诊断或胚胎植入前遗传测试。

在考虑快速外显子组测序的临床效用时，还需要考虑所采用的测序技术的背景。离子通道快速外显子组测序提供了单样品运行和速度方面的灵活性和经济优势。然而，本研究中使用的离子通道外显子组展示了对插入缺失的敏感性降低，特别是在同源聚合性区域。因此，虽然这影响的病例数量很少，但这仍然是离子通道测序的一个严重限制，在应用于这种情况时应予以考虑。

从经济的角度来看，对于我们的患者群体，仅考虑年度医疗费用和程序费用（如肝脏或骨髓移植），快速外显子组测序的应用仅占总费用的很小一部分（1.27%）。然而，从罕见病患者的终身医疗费用的角度来看，快速外显子组测序的费用相对较低，测试和临床价值的证明被显著放大。在本研究患者群中，应用快速外显子组测序所节省的医疗费用远超快速外显子组测序费用。

 结 论 

这项研究显示，在我们的亲缘关系较近婚配人群中，快速外显子组测序（RES）具有很高的临床效用，使用了与之前在非亲缘关系较近婚配人群中相似的定义。此外，我们强调了在这种特殊情况下的临床效用的几个独特方面。我们希望我们的结果能够增加支持将快速外显子组测序作为急性病例的标准临床检测的证据。

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