近日，《21羟化酶缺陷导致的先天性肾上腺皮质增生症的实验室诊断共识》正式发布，进一步规范了21-OHD的实验室诊断。《共识》高度肯定了三代CAH检测技术。

01、21-OHD基因检测难点

21-OHD是由CYP21A2基因的纯合或复合杂合致病变异所致。CYP21A2 上游存在一个假基因CYP21A1P，真假基因外显子序列的同源性高达98％，内含子的同源性达96％。

由于假基因与CYP21A2 序列高度同源且位置相近，CYP21A2 的变异多来源于真假基因之间的重组或微交换。重组所产生的真假融合基因，可能体现为相应真基因的不同范围的缺失。不同的缺失导致的表型也有所差异，当缺失范围包含与CYP21A2 毗邻的TNXB 基因时，会导致患者合并EhlersＧDanos综合征。因此需对断裂点进行精准检测，以帮助预测表型。

实验室常采用Sanger测序+MLPA对21-OHD进行分子诊断。但由于CYP21A2 基因的复杂性和技术局限性，仍然存在Sanger测序＋MLPA漏检的可能性。二代测序技术可以实现短片段(通常小于150 bp)的高通量测序，对序列特异性高的基因有较高的准确性。

然而，对于CYP21A2 基因而言，由于存在同源度极高的假基因，在分析数据时无法区分短片段的来源，导致二代测序结果不可靠。但二代测序技术对于非21-OHD的CAH病例有进一步鉴别诊断的作用。面对多个变异位点时，以上两种解决方案都需要依赖家系验证来区分变异位点的顺反式关系。

02、三代测序CAH基因检测优势

共识对三代测序在CAH检测中的的优势进行了全面阐述。三代测序技术克服了二代测序读长短的不足，测序最长读长超过200 kb。其中PacBio测序平台可通过对原始单分子模板(可达30 kb)进行多次测序，矫正单分子随机测序的错误，获得高准确性的一致性序列，再结合高深度测序（多个单分子模板）获得准确的变异信息。

长片段多重PCR技术可以扩增CYP21A2、CYP21A1P 以及真假基因同源重组形成的基因缺失、基因重复和大片段基因转换。三代测序可获得每个PCR扩增片段的完整序列，从而有效区分真假基因，并准确地鉴定出点变异、Indel、缺失、重复和大片段基因转换。

利用三代测序进行21-OHD基因检测具有以下优势：

利用同一反应体系同时检测CYP21A2 基因所有类型的致病变异，包括复杂基因重复和大片段的基因转换；

可以准确区分CYP21A2 和CYP21AIP，结果判读直观，不受真假基因同源性的干扰；

不依赖于家系基因型分析，可以直接分析两个和多个变异之间的顺反式关系；

可对融合基因进行一次性完整测序，能够直观地检测出断裂点。

03、实验室目的及适用人群

首先，明确21-OHD的诊断对CAH的及时治疗、改善预后及遗传咨询至关重要。21-OHD的实验室诊断包括生化诊断和基因诊断。对于出现以下表现的患者，需要首先进行生化检查，结合临床表现判定诊断的方向，最终进行基因诊断。

图2 诊断流程

21-OHD的生化诊断17α-OHP的水平检测应在清晨（上午８点前）进行。对于育龄期女性，应在卵泡期进行类固醇激素的测量，其结果可能因检测方法而异。经典型21-OHD的患者，包括21-OHD的SW型和SV型，其未经激发的17α-OHP值通常超过30nmol/L。需注意SV型和NC型的CAH患者17α-OHP水平可能难以区分。

图3 适用人群

04、21-OHD的生化诊断

对CAH新生儿筛查阳性或临床高度疑似的患者，检测其类固醇激素及其前体代谢物的水平是诊断CAH的主要手段。

图4 生化诊断

05、21-OHD的基因诊断

01 诊断难点

21-OHD是由CYP21A2基因的纯合或复合杂合致病变异所致，CYP21A2基因编码21羟化酶（P450C21），并有一个高度同源的假基因CYP21A1P；真假基因外显子序列的同源性高达98%；内含子的同源性达96％，二者均定位于6p21.33区的HLA主要组织相容性复合体中。

图5 真基因CYP21A2 和假基因CYP21A1P

造成的致病位点的差异

CYP21A2基因的变异类型变异包括错义、无义、剪接位点变异、小插入缺失（indel），而且真假基因会发生复杂的同源重组。

图6 复杂的同源重组

02 致病性评价标准

对于文献中多次报道的致病变异以及在ClinVar等数据库中被归类为“致病”或“可能致病”的常见变异，无需进一步评估其致病性。

对于其他变异，包括已被ClinVar数据库中收录但不太常见的变异，须参照美国医学遗传学和基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南。

03 基因型-表型相关性

多数研究认为，90％-95％的21-OHD患者的临床表型与其所携带的CYP21A2的变异存在相关性。

04 基因诊断方法

要提醒注意的是，需明确CYP21A2基因有无致病变异，并明确携带致病变异的拷贝与正常拷贝在两条等位基因上的分布情况，从而综合判断每条等位基因是否正常。

图7 CYP21A2基因重复

对等位基因致病性判读的影响

05 判读错误的原因及解决方案

① 等位基因脱扣。需使用多对覆盖CYP21A2基因的引物对真基因进行扩增，确保不会因引物特异性问题而导致漏检；

② CYP21A2基因重复携带变异。重复拷贝若包含MLPA特异性结合位点的变异，可导致MLPA无法检测出此重复。出现这种情况时，需仔细观察测序峰图，并结合MLPA的结果进行判断。

③ 漏检杂合携带者。CYP21A2基因的拷贝数尽管为２，但两个CYP21A2基因位于同一条染色体上，另一条染色体为CYP21A2基因完全缺失。此时需结合家系数据和单倍型分析对CYP21A2基因在两条等位基因上的分布进行准确的分析；

④ 在某些情况下，真假基因重组形成的融合基因可能被同时扩增，检测到的致病变异可能被错误地定位到功能基因上。此时需采用多对覆盖CYP21A2基因的引物对真基因进行扩增，并结合家系数据和单倍型分析对融合基因的结构进行准确的分析。

06、基于实验室诊断的遗传咨询

21-OHD的遗传咨询可通过对先证者进行基因检测，结合家族史，为患者家庭提供可能的疾病病程、家庭成员的遗传状况等信息。

图8 实验室诊断的遗传咨询流程

07、鉴别诊断

在大规模筛查中，具有高17α-OHP水平的其他CAH疾病包括PORD、３β-HSD和11β-OHD。

图9 CAH鉴别诊断

 结 语 

本共识建议应重视并规范21-OHD的实验室诊断方法，提供了各种生化及基因诊断方法的介绍及注意事项，并强调了基于实验室诊断的遗传咨询，希望本共识可为国内同行提供参考。

参与本共识制定的人员，以单位和姓名为序

广西医科大学第二附属医院（陈少科、范歆）；

广州市妇女儿童医疗中心（黄永兰）；

首都医科大学附属北京儿童医院（巩纯秀）

华中科技大学同济医学院附属同济医院（罗小平）；

三亚市妇幼保健院（王洁）；

南京市妇幼保健院（许争锋）；

上海市儿童医院/上海交通大学医学院附属儿童医院（邹琳、李嫔）；

上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院（王剑）；

复旦大学附属儿科医院（王艺）；

上海交通大学医学院附属瑞金医院（叶蕾）；

上海交通大学医学院附属新华医院（梁黎黎、占霞、邱文娟、孙昱、余永国、顾学范）；

中南大学（邬玲仟）；

浙江大学医学院附属儿童医院（杨茹莱）；

参考文献

中华医学遗传学杂志2023年7月第40卷第7期 ChinJMedGenet,July2023,Vol.40,No.7

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